Only Perception: 反布朗運動的單分子電動力阱

2011-05-30

反布朗運動的單分子電動力阱

Where no lab has gone before: Single-Molecule Electrokinetic Traps
http://www.physorg.com/news/2011-05-lab-single-molecule-electrokinetic.html

By Stuart Mason Dambrot, May 25, 2011

(PhysOrg.com) -- 為了在溶液中研究大型蛋白質複合體以及長長的 DNA 鏈，研究者會使用所謂的分子阱。然而，當與小分子一起使用時，由於其高度擴散性，分子阱已被證明無效。對付這種限制，首先是透過諸如表面附著（surface attachment）與雷射光鉗（laser tweezers）這樣的單分子固定技術，然而，這有其缺點：前者會擾亂生化結構，而後者需要分子附著在大圓珠上。之後在 Stanford 大學開發的分子阱，是基於電腦的影像捕捉與處理來追蹤單個分子的布朗運動，接著藉由施加一可變電壓回饋（variable voltage feedback）來抵銷。現在，哈佛大學的研究者已設計出一套反布朗運動電動力（Anti-Brownian ELectrokinetic，ABEL）阱，那將螢光顯微術（fluorescence microscopy）與即時電動力回饋（real-time electrokinetic feedback）結合，藉此捕捉任何可溶的、可發出螢光的（fluorescence-capable）分子，其大小可比之前的可能性小 800 倍。

這套 ABEL trap 是由哈佛大學物理系以及化學與化學生物系教授 Adam E. Cohen 及其在生物物理學計畫中的學生 Alex Fields 所開發，其運作是藉由追蹤一個粒子的布朗運動，然後施加回饋力到粒子上以抑制布朗運動（Brownian motion）。這套系統利用螢光（附著在粒子上的染料分子）以高精確度的方式來追蹤粒子的布朗運動而不會傷害它。

分子阱面臨一種基本的、在歷史上難以克服的挑戰：即，在低溫真空下（那遵循牛頓的慣性與動量定律）以及在溶液中，原子之間的行為差異。在後面的條件裡，分子每隔幾皮秒（picoseconds）就會碰撞（對照下，在常壓中，氣體內每秒有數十億次的碰撞，而在超高真空下，每隔幾秒鐘才完成一次典型的原子捕捉），這使其位置與軌跡的追蹤及分析非常困難。因此，需要截然不同的分子捕捉策略。

雖然自 1990 年代以來螢光已被運用在單分子成像中，不過這些早期系統需要利用某種化學繫鏈方法（tether）將分子固定在某一側表面上。不幸的是，這些繫鏈方法常擾亂（perturbed）或修改受陷粒子，所以並不能保證粒子的表現與其在溶液中自由漂蕩時一樣。其他早期的分子阱需要分子附著在小型珠狀結構上，以便被固定，但那也會擾亂研究中的分子。

不過，在 2005 年，由 Cohen 與史丹佛大學 W. E. Moerner 所進行的研究導致一種將 CCD 相機連接到電腦的分子阱，且透過即時的影像比對來決定分子的位置。電腦接著施加一種隨時變化的回饋電壓到溶液中，使電動力（electrophoretic）與電滲透壓漂蕩（electroosmotic drifts）結合以抵銷布朗運動。

儘管有了長足的進步，不過該系統的速度受限於軟體速度以及相機的畫面數（frame-rate）。但在去年 Cohen 待在史丹佛期間，他以客製的硬升級了這種分子阱，使其具有單一光子的敏感度，這不但允許更精確的測量，還能測定光子源自何處。

Cohen 表示，"ABEL 能運作的關鍵在於使回饋盡可能的快與準。然而，當我們試圖捕捉更小的粒子時，這任務因為二種理由變成了挑戰。首先，較小的粒子擴散更快 -- 擴散量與分子半徑成反比，所以 1 nm 粒子的擴散速度比 10 nm 的粒子快 10 倍。其次，粒子愈小會愈暗 -- 而且受到只有一個螢光染料分子的限制，我們無法從它那裡獲得非常多光子。所以到最後，我們得試圖追蹤這種移動速度難以置信地快速、黯淡的物體，而且我們需要在次毫秒的時間解析度以及微米級的空間解析度下辦到這件事。那太難了。"

讓 ABEL trap 能捕捉單一染料分子的主要創新在於一種統計學上十分精密的追蹤演算法，那以近乎最佳的方式利用每一個被偵測到的光子資訊，為此，演算法由 Fields 設計並在客製化的數位硬體（稱為 FPGA）中實作出來。"FPGA 每秒能跑幾十萬次演算法，" Cohen 解釋，"所以每當我們偵測到一個來自受陷分子的光子時，演算法會將這筆資訊整合到該粒子在哪裡的估計中，從而產生適當的回饋訊號，接著等待下一次的光子偵測。"

其成果是一套成像與偵測系統，那藉由統計學上的最佳方式結合所有光子資訊，對於光子來源位置提供最可能的估計，表現出迄今最快與最敏感的追蹤。此外，在 FPGA 上實作驗算法，使得演算法能以 9 μs 的速度執行，那顯然比典型的光子發射間隔短。（相較之下，基於 CCD 相機的系統需要花 4.5 ms 來處理發射光子資料，而 Fields 之前所開發的演算法則需要 25 μs 的運行時間。）

Cohen 承認，儘管有這些優勢，ABEL 並不完美。"ABEL 的限制之一是僅能捕捉幾秒鐘，因為氧敏染料分子易受雷射所誘發的光漂白（photobleaching）影響。光激發有可能導致擾亂染料分子的光化學變化出現。"然而，他補充道，光漂白現象可藉由添加耗氧的化學物質與其他化學物質，使這種影響減到最低，例如抗氧化劑與自由基清除劑。

接下來，Cohen 打算要在阱上面使用其他種類的光譜術。"我們想要在受陷分子上打上不同顏色的光，以及從光子中取得更多資訊 -- 它們的偏振、波長與精確時機 -- 分子發射它的時間。一個在阱中的分子正在做什麼，這種額外資訊將賦予我們一幅更詳細的圖像。"

Cohen 也正在發明各種額外的射流（fluidics）到設備上，那流入、流出各種不同的試劑。"如果我們能捕捉到一個酵素那真的太棒了，然後讓基質或 ATP 流入，並看看酵素的化學動態如何改變。"

考慮到應用層面，Cohen 希望在短期內研究一小段 DNA 的動力學以及 DNA-蛋白質的交互作用。"DNA 當然已被好好地研究過；不過那裡仍有許多我們不知道的、真正基本與重要的東西，" 他指出。"例如，如果將 DNA 折的很彎，我們不知道會發生什麼事，或著，在序列下，DNA 如何依賴其力學特性。" 這些問題對於 DNA 在細胞中的作用很重要，因為在細胞中的 DNA 常繞著組織蛋白（histones，組蛋白）高度彎曲，或是被 DNA 結合蛋白高度彎曲。我們也不完全明白 DNA 折疊蛋白如何精確地找到分子上的結合點。這些蛋白有可能會在搜尋中，偵測分子的局部力學特性。"

長遠來看，該團隊將研究一大堆蛋白質與分子機器的內部動力學。"現在，我們幾乎能捕捉任何分子而不需要將之繫鏈在表面上，我們希望能觀察許多個別分子的動力學，那到目前為止仍不可能在單一分子的層次上研究。"

※ 相關報導：

＊ Electrokinetic trapping at the one nanometer limit
http://www.pnas.org/content/early/2011/05/09/1103554108